ATII細(xì)胞的分離培養(yǎng)需兼顧細(xì)胞純度與活性，核心步驟包括肺組織獲取、酶解消化、細(xì)胞純化及體外培養(yǎng)。首先，選取6-8周齡SPF級小鼠，經(jīng)頸椎脫臼法處死并無菌暴露胸腔，通過氣管插管注入胰蛋白酶-膠原酶混合消化液，37℃恒溫孵育20-30分鐘，使肺組織間質(zhì)松散、細(xì)胞間連接解離。隨后，機械吹打肺組織獲得單細(xì)胞懸液，經(jīng)100目濾網(wǎng)過濾去除組織碎片，采用差速貼壁法結(jié)合免疫磁珠分選技術(shù)（針對ATII細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物SP-C）純化細(xì)胞，可將細(xì)胞純度提升至85%以上。體外培養(yǎng)時，采用含10%胎牛血清、表皮生長因子（EGF）及胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒（ITS）的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中，細(xì)胞接種后24小時貼壁生長，48-72小時進入對數(shù)增殖期，此時細(xì)胞形態(tài)呈立方狀，胞質(zhì)內(nèi)可見典型的板層小體（PS儲存結(jié)構(gòu)）。

 

　　培養(yǎng)體系的優(yōu)化是保障ATII細(xì)胞功能穩(wěn)定的關(guān)鍵。研究表明，基質(zhì)膠包被培養(yǎng)皿可模擬肺泡基底膜微環(huán)境，顯著提高細(xì)胞貼壁率與PS分泌能力；添加地塞米松可增強SP-C基因表達(dá)，維持細(xì)胞分化表型；而避免過高血清濃度（>15%）可減少成纖維細(xì)胞污染，防止細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致功能喪失。此外，體外培養(yǎng)時間不宜超過7天，否則ATII細(xì)胞易發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化或分化為ATI細(xì)胞，影響實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。

 

　　ATII細(xì)胞的核心功能研究主要集中于三個方面：一是PS合成與分泌調(diào)控，其分泌的PS可降低肺泡表面張力、防止肺泡塌陷，該功能異常與新生兒呼吸窘迫綜合征、急性呼吸窘迫綜合征密切相關(guān)；二是增殖分化潛能，在肺損傷后，ATII細(xì)胞可通過自我更新并分化為ATI細(xì)胞，完成肺泡上皮的修復(fù)重建，其分化機制涉及Notch、Wnt等信號通路的調(diào)控；三是免疫調(diào)節(jié)作用，ATII細(xì)胞可表達(dá)Toll樣受體，識別病原體相關(guān)分子模式，分泌細(xì)胞因子參與肺部炎癥反應(yīng)的調(diào)控，在肺部感染與免疫失衡疾病中發(fā)揮重要作用。